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SILDENAFIL, EFECTO SOBRE EL DESARROLLO DE LA PLACENTA EN UN MODELO MURINO DE PRE-ECLAMPSIA. RESULTADOS PRELIMINARES.

Autores:
Carlos Eugenio Motta1, Carolina Natalia Zanuzzi2, María Carolina Grosso3, Natalia Yanina Picco4, Romina Valeria Bellingeri5, Fabrisio Eduardo Alustiza6, Adriana Beatriz Vivas7, María Cristina Romanini8, Claudio Gustavo Barbeito9.

1 Ayudante de primera, Departamento de Patología Animal, Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto, Argentina.
2 Doctora Jefe de Trabajos Prácticos Histología y Embriología Facultad Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata, Buenos Aires Argentina, Investigadora Asistente CONICET, Argentina
3 Doctora, Ayudante de primera, Histología, Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto, Argentina.
4 Becario Postgrado tipo II CONICET, Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto, Argentina.
5 Becario Postgrado tipo II CONICET, Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto, Argentina.
6 Ayudante de primera, Embriología, Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto, Argentina.
7 Doctora, Profesor asociado, Histología, Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto, Argentina.
8 Doctora, Profesor adjunto, Embriología, Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto, Argentina.
9 Doctor Profesor Titular de Histología y Embriología y Profesor Adjunto de Patología General. Facultad Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata, Buenos Aires Argentina, Investigadora Independiente CONICET, Argentina

E-mail: cmotta@ayv.unrc.edu.ar

RESUMEN

El crecimiento de los vasos sanguíneos en la placenta depende, entre otros factores, del óxido nítrico (NO). El metil L-nitroarginina éster (L-NAME) es un inhibidor de la Óxido Nítrico Sintetasa y se utiliza como modelo de pre-eclampsia murino. El Sildenafil es un inhibidor específico de la 5-fosfodiesterasa que aumenta los efectos vasodilatadores del NO sobre el musculo liso vascular. El objetivo fue determinar los efectos del Sildenafil sobre el desarrollo placentario en un modelo murino de pre-eclampsia inducida por L-NAME. Se utilizaron 20 ratones hembras preñadas. Se dividieron en 4 grupos: 1) Control, 2) L-NAME, 3) Sildenafil y 4) L-NAME+Sildenafil. A partir del día 7 de preñez se administró L-NAME (50 mg/Kg, SC) y a partir del día 8 Sildenafil (10 mg/Kg, PO). Los tratamientos se realizaron hasta el día 16 y los animales fueron sacrificados el día 17. Se midieron y pesaron las placentas. Se realizaron cortes histológicos para medir el porcentaje de marcación del endotelio fetal placentario con lectina BS-I. Se observó una disminución estadísticamente significativa del peso de la placenta en los grupo L-NAME y L-NAME+Sildenafil y una disminución estadísticamente significativa del porcentaje de marcación en el grupo L-NAME. El tratamiento con L-NAME disminuyó el peso de la placenta y el porcentaje de marcación del endotelio fetal. Se observó un aumento de este último cuando se trató conjuntamente con Sildenafil. En conclusión L-NAME altera el desarrollo de la placenta y el Sildenafil podría contrarrestar los cambios producidos en las placentas de ratones con pre-eclampsia inducida por L-NAME.

Palabras Clave: Pre-eclampsia; Sildenafil; lectina BS-I; L-NAME; modelo murino.

INTRODUCCIÓN

En humanos y roedores, la decidualización ocurre en la preñez temprana, cuando células estromales del endometrio proliferan transitoriamente y luego se diferencian en grandes células poliploides deciduales. La implantación de los conceptos en los roedores estimula la decidualización en un tiempo y espacio específico. Esto comienza en la región anti-mesometrial, adyacente al concepto, para formar la zona decidual primaria. Luego se extiende a través de la mayor parte del área antimesometrial restante, formando la zona de decidual secundaria. Finalmente, la decidualización continua en el área mesometrial del endometrio y allí se forma la placenta definitiva (Bany y Cross, 2006). La placenta de la rata es similar a la de humanos, ambas son de forma discoide y hemocoriales. El laberinto representa la interfase entre la circulación materna y fetal en la placenta. Durante la preñez, las arterias en espiral del útero de la rata experimentan cambios, que son similares a los cambios fisiológicos en las arterias espirales de humanos, aunque el tiempo de invasión del intersticio trofoblástico es significativamente diferente (Nash y Ericsson, 2007).
Las lectinas son proteínas o glicoproteínas que poseen afinidad de unión específica a residuos sacáridos o glicoconjudados (glicoproteínas o glicolípidos) y son usadas extensamente como agentes histoquímicos para investigar la distribución de residuos de azúcar en diversos órganos y tejidos (Sgambati et al., 2007). En los roedores, se utiliza la lectina BS-1 que se une a las células endoteliales, para que facilitar la diferenciación de los capilares fetales, que poseen una capa de células endoteliales, de los espacios vasculares maternos que no poseen células endoteliales (Lewis et al., 2001).
El óxido nítrico (NO) es uno de los factores claves para la regulación de los cambios adaptativos que ocurren en los vasos sanguíneos uterinos y placentarios durante la preñez (Zhu et al., 2005) y puede participar en la invasión vascular del trofoblasto (Ogando et al., 2003). La formación del NO es catalizada por la enzima oxido nítrico sintetasa (NOS). El aumento de la producción de NO en úteros de rata durante la preñez es el resultado del incremento de expresión de la oxido nítrico sintetasa inducible (iNOS) (Suzuki et al., 2009). La expresión del factor de crecimiento endotelio vascular (VEGF) activa las enzimas NOS y se libera el NO el cual potencia la acción del factor angiogénico y de esta manera se favorece la viabilidad embrionaria (Rivas et al., 2006; Zhu et al., 2005; Vonnahme y Ford, 2003). El metil L-nitroarginina éster (L-NAME), es un inhibidor de la NOS que reduce la formación de NO y da lugar a cambios patológicos similares a los observados en mujeres con pre-eclampsia, tales como la vasoconstricción renal grave, proteinuria, trombocitopenia (Cauli et al., 2010).
En los animales, se demostró que la liberación de NO puede conducir a la relajación del músculo liso a través de la vía mediada por monofosfato guanosina cíclico (cGMP). La duración de la acción del cGMP está controlada mediante una enzima citosólica, la 5-fosfodiesterasa (5-PDE) (Reyna Villasmil et al., 2008). Se han identificado inhibidores específicos de distintos subtipos de 5-PDE, los cuales pueden aumentar los efectos de los nucleótidos cíclicos sobre el tejido blanco (Sher y Fisch, 2002). El Sildenafil es un inhibidor específico de la 5-PDE, que aumenta los efectos vasodilatadores del NO sobre el músculo liso vascular ya que previene la degradación del cGMP. (Sher y Fisch, 2002; Yildirim et al., 2010). Los mecanismos involucran efectos beneficiosos sobre vías de transducción que estimulan la angiogénesis, junto con un aumento en el número y la actividad de las células progenitoras endoteliales (Dussault et al., 2009). En mujeres con endometrio delgado sometidas a fertilización in vitro (FIV), el Sildenafil ha aumentado el desarrollo endometrial en un 70%. de las pacientes tratada, aumentando las tasas de implantación y de embarazo (Sher and Fisch, 2002). El uso de tabletas de Sildenafil intravaginales tuvo un efecto antiabortivo en pacientes con abortos espontáneos repetidos sin causa aparente (El-Far et al., 2009). En ratas, el uso de Sildenafil no indujo cambios fetales con gestaciones normales (Sasser y Baylis, 2010). La disfuncionalidad de la vía de señalización del NO, produce una inadecuada perfusión uterina, como se observa en embarazos con pre-eclampsia o con restricción del crecimiento intrauterino complicada. La investigación en seres humanos y animales está centrada en las terapias que manipulan la vía de NO, incluyendo los donadores de NO y Sildenafil (Hale et al., 2010).
Por lo antes mencionado se propuso que en un modelo murino de pre-eclampsia el uso de Sildenafil favorece los efectos vasodilatadores y estimuladores de la angiogénesis mediados por NO.

MATERIAL Y MÉTODOS

Animales
Se utilizaron 20 hembras vírgenes de ratón de la cepa Balb/c de 80 a 120 días de edad, las cuales fueron apareadas con machos adultos. El día de aparición del tapón mucoso vaginal (post-coital) fue considerado como el día 0 de preñez. Los animales fueron mantenidos a temperatura e iluminación controladas, con alimento y agua ad libitum. Los procedimientos y manejo realizados en este trabajo fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad Nacional de Río Cuarto.

Conformación de grupos
Los animales fueron divididos en 4 grupos experimentales:
1) Control (n=5): recibió 0,04 ml de solución fisiológica vía subcutanea (SC) a partir del día 7 de preñez y 0,04 ml de agua destilada en forma oral (PO) a partir del día 8.
2) L-NAME (n=5): recibió L-NAME (50 mg/kg) en 0,04 ml de solución fisiológica SC a partir del día 7 de preñez y 0,04 ml de agua destilada PO a partir del día 8.
3) Sildenafil (n=5): recibió 0,04 ml de solución fisiológica SC a partir del día 7 de preñez y Sildenafil (10 mg/kg) en 0,04 ml de agua destilada PO a partir del día 8.
4) L_NAME + Sildenafil (n=5): recibió L-NAME (50 mg/kg) en 0,04 ml de solución fisiológica SC a partir del día 7 de preñez y Sildenafil (10 mg/kg) en 0,04 ml de agua destilada PO a partir del día 8.
Los procedimientos se repitieron hasta el día 16 de preñez inclusive.
Los animales fueron sacrificados el día 17 de preñez mediante la técnica de dislocación cervical.

Análisis morfométrico
Para la obtención de las muestras se realizó una laparotomía por la línea media, se extrajo el útero completo y se contó el número total de fetos.
Posteriormente, el útero fue dividido en sus dos cuernos, las placentas (sin membranas embrionarias) del cuerno uterino izquierdo se colectaron, midieron y pesaron para el análisis morfométrico.

Lectinhistoquímica
El cuerno uterino derecho fue inmediatamente fijado en formol tamponado al 10% con una relación 10:1 de fijador-tejido. Para el análisis histoquímico se procesaron solamente las vesículas embrionarias centrales del cuero uterino derecho de cada animal. Mediante la técnica histológica convencional se obtuvieron cortes delgados para realizar la marcación de las células del endotelio del laberinto placentario con Lectinhistoquímica, se utilizó la lectina BS-I.
Para evaluar el porcentaje de marcación se fotografiaron los cortes histológicos (cámara Cannon G5, programa ZoomBrowser Ex 5.0) y se capturaron 5 imágenes por corte con un aumento de 400x. El cálculo del porcentaje marcado se realizó con una macros creada con el programa de procesamiento y análisis de imágenes, ImageJ 1.46j.

Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA de una vía  y se probarón los supestos de homogeneidad de varianza y de normalidad, mediante el programa Infostat Versión 2009.

RESULTADOS

Análisis morfométrico
El número y la superficie placentaria de las vesículas embrionarias del cuerno izquierdo fueron comparadas en los cuatro grupos experimentales. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en el número promedio de placentas ni en la superficie placentaria para los grupos evaluados. El peso placentario fue significativamente menor en los animales tratados con L-NAME y con L-NAME+ Sildenafil en comparación con los no tratados (p=0,0016) (Tabla 1).
Lectinhistoquímica
La figura 1 muestra el tejido placentario marcado con Lectinhistoquímica. La figura 2 corresponde al tejido placentario luego de realizar el análisis con la macros desarrollada con el programa ImageJ.
El porcentaje de marcación con Lectinhistoquímica fue significativamente menor en el grupo L-NAME con respecto a los otros grupos (p=0,0025) (Figura 3). En el grupo L-NAME+Sildenafil no se observo diferencia estadísticamente significativa con los grupos Control y Sildenafil.

DISCUSIÓN

La disfuncionalidad de la vía de señalización del NO, produce una inadecuada perfusión uterina. Cauli et al. (2010) demostraron que el tratamiento con L-NAME, redujo la formación de NO y dio lugar a cambios patológicos similares a los observados en mujeres con pre-eclampsia. En nuestro trabajo se observó que el tratamiento con L-NAME disminuyó significativamente el peso placentario promedio de los grupos tratados con L-NAME y con L-NAME + Sildenafil. La superficie placentaria fue menor en estos grupos aunque estas diferencias no fueron estadísticamente significativas.
La pre-eclampsia es un síndrome que se define como un desorden multisistémico. Es un trastorno que se produce en dos etapas, la primera se caracteriza por una falla en la remodelación completa de los canales de gran diámetro de las arterias espirales, con una reducción del flujo sanguíneo placentario. La segunda etapa es aquella donde la reducción de la perfusión sanguínea induce un estado de hipoxia. Roberts y Lain (2002) describieron que en ésta etapa disminuye la secreción de factores angiogénicos, como el VEGF y el factor de crecimiento placentario. En nuestro estudio se encontró una disminución significativa en el porcentaje de células endoteliales en el grupo tratado L-NAME con respecto a los otros grupos, lo que demuestra que la aplicación del L-NAME induce una disminución del área vascular fetal. Este efecto podría estar mediado por una disminución del NO en el trofoblasto fetal debido al efecto inhibitorio del L-NAME sobre la NOS. Es bien conocido que el NO es una molécula de gran importancia en la regulación de los cambios adaptativos que ocurren en los vasos sanguíneos uterinos y placentarios durante la preñez (Zhu et al., 2005).
Sasser y Baylis (2010) demostraron que en ratas con gestaciones normales, el uso de Sildenafil no induce cambios fetales. Nuestros resultados concuerdan con estos autores ya que no se observaron cambios placentarios en ratones con gestaciones normales tratados con Sildenafil. Sin embargo, el efecto del L-NAME sobre el trofoblasto placentario fue contrarrestado por el uso de Sildenafil, esto fue demostrado por el aumento de las células del endotelio del laberinto placentario observada en el grupo L-NAME+Sildenafil.

CONCLUSIONES

La disminución en el porcentaje de células del endotelio del laberinto placentario junto a la disminución del área y del peso de la placenta, probablemente sean debido a una reducción del flujo sanguíneo, producto de un estado de hipoxia placentaria. Estos cambios fueron contrarrestados por el uso del Sildenafil.

BIBLIOGRAFÍA